抑制性差减杂交技术在基因克隆中的运用现状论文

2020-01-16 17:08:01 197

摘要：抑制消减杂交是一种克隆差异基因的新技术。它可以研究细胞繁殖，发育，分化，衰老和死亡过程中生命的差异表达和相关基因。相关基因的分子克隆提供了强大的技术工具。简要概述了抑制性消减杂交的基本原理，优越性，缺陷及其在相关基因克隆中的应用研究进展。

关键词：基因克隆；抑制性消减杂交；应用

生物的生命过程伴随着异常复杂的生物学和生化变化，这些变化是相关基因在生物中的有序表达和调控。对相关差异表达基因的深入研究可以更好地了解生物的生命活动规律。目前，分离差异表达基因的主要技术是差减杂交和差异化，但这些技术具有重复性差，灵敏度低的缺点。随着现代PCR技术的发展，已经开发了基于PCR技术的一系列分离差异基因表达的新技术。 SSH技术是一种基于抑制PCR和减性杂交技术分离差异表达基因的简便快捷方法。该技术在研究基因克隆，基因表达和基因功能方面具有明显的优势。抑制性差减杂交技术在基因克隆中的运用现状论文 1 。简要介绍了SSH技术的应用现状和研究前景，旨在使SSH技术的应用获得更深刻的认识。

1 SSH技术的过程及其优缺点

1.1 SSH技术的过程

SSH研究中使用的材料可以是基因组DNA或c DNA，用于分离两个样品中的特定基因或差异表达的基因。基本过程是：提取两种不同生物的DNA或c DNA；将用限制酶消化的Tester DNA分为2部分，分别与2种衔接子连接。然后对过度消化的驱动程序DNA杂交中的2个部分进行测序。当最后将这两个DNA部分混合并杂交时，允许同源单链DNA分子杂交。减去的序列可以通过PCR扩增和克隆进行分析。

1.2 SSH技术的优势

高效率和高速度。在SSH杂交实验中，可以同时分离数百个差异表达的基因。高灵敏度。在退火过程中，高丰度单链DNA同源杂交比低丰度单链DNA更快，从而导致原本丰度不同的单链DNA的相对含量可以保持一致。基因表达克隆。误报率很低。经过2次杂交和2次PCR扩增以选择性扩增差异表达的靶DNA后，特异性基因的筛选率提高，假阳性率大大降低。它简单易行，对设备要求不高。低背景和高重复性。

1.3 SSH技术的缺点

SSH技术不适用于基因组中少数限制性位点；分离的差异表达基因片段需要全长扩增；起始材料要求更高，不适用于来源困难的样品。对测试材料的要求较高，而对测试材料之间的差异的要求则较低。

2 SSH技术的应用

2.1 SSH技术在医学中的应用

孙寿娟等

使用SSH技术构建舌鳞状细胞Tca8113细胞系中具有高醛脱氢酶活性和低醛脱氢酶活性的细胞的差异表达基因c DNA库。用Trizol分别提取两个细胞的总RNA。使用SSH技术对两组RNA进行差异基因筛选和扩增。克隆的片段平均分布在250〜750 bp，无假阳性克隆。测序结果的同源性比较分析表明，肿瘤相关基因为SLC25，A13 NPC1，KLHL2，BARD1，WAPL，Notch2，EEF2K。车宏华等。

克隆了受病毒攻击的宿主细胞中受中药有效成分调控的基因，结果表明核糖体蛋白L27a在中药组中高表达，而在病毒组中的表达减弱或受到抑制。益气活血中药复方可以影响宿主细胞核糖体蛋白L27a的表达，有效保护心肌，阻断疾病的进展，达到治疗病毒性心肌炎的目的。

李寿明等。

使用抑制性消减杂交法鉴定了暴露于铅的雌性小鼠海马中的差异表达基因，构建了近200个克隆的消减基因文库，获得了93个有效克隆。克隆并鉴定了铅诱导的母鼠幼鼠海马中差异表达的基因，该基因显着降低了它们的学习和记忆能力。总共克隆并鉴定了43个不同基因和4个未知功能基因。这些基因包括管家基因以及与细胞蛋白质折叠，信号转导，应激反应和DNA甲基化相关功能有关的基因。

2.2 SSH技术在植物学中的应用

刘磊等

用SSH筛选与青枯雷尔氏菌致病性相关的基因，并研究该菌株的致病分化机制，方法是：对待测菌株构建了Po82抑制消减杂交文库，结果表明，该文库具有较高的衔接子连接和文库构建效率，平均插入长度为300 bp，文库构建质量良好。从文库中随机选择阳性克隆进行测序和共同筛选鉴定出44株Po82菌株的差异基因。生物信息学分析结果表明，获得的差异基因主要与代谢，膜结构，转座酶，毒力，分泌蛋白，转录因子和未知功能有关。闵卓等。

使用赤霞珠葡萄新芽上的冬芽和夏芽作为材料（夏季芽作为驱动剂，冬芽作为测试对象），并使用SSH技术构建冬芽和夏芽的ac DNA库。，并筛选了冬芽和夏芽。芽的差异表达基因片段，结果发现了一些在冬芽中表达较高的基因，如编码MADS FLC样蛋白，钙依赖性蛋白激酶，NADP依赖性苹果酸，细胞壁水解酶，细胞壁松弛蛋白等。，体外蛋白β亚基，热休克蛋白，衰老相关蛋白，细胞色素P450，细胞壁相关蛋白等基因；同时，线粒体蛋白基因，开花相关基因，未知蛋白基因，ATP合酶β亚基基因，MADs FLC样蛋白基因与生理芽休眠有关。叶晓明等。

使用SSH技术，使用在10℃可育温度和26℃无菌温度下的热敏雄性不育系K121S作为三核花蕾的材料，在可育温度下的c DNA作为驱动力，使用SSH技术根据不育温度下的SSH文库构建，随机选择97个阳性菌落进行测序，获得20个表达序列标签（EST），包括与ATP合酶β亚基和Rubb羧化酶小亚基同源的EST。奠定了获得与生育力转化相关的基因并揭示K121S生育力转化的分子机制的基础。

2.3 SSH技术在微生物学中的应用

李苗等

使用SSH技术搜索副猪嗜血杆菌的毒力基因，使用非毒力H465菌株和毒力SW124菌株作为材料，并构建了一个SSH库。使用Southern杂交和PCR鉴定筛选差异基因片段。从构建的文库中获得7个特异性差异基因片段，其中2个差异基因片段与功能未知蛋白基因相关，其中5个分别为膜多糖磷酸酶/糖基转移酶，核糖甲酰甘氨酸合酶，核糖体蛋白丙氨酸，转移酶噬菌体重组蛋白和ABC。型硝酸盐，碳酸氢盐/由磺酸盐转运系统编码的周质蛋白具有同源性。

朱浩丹使用SSH技术将无毒力菌株SH040917SS9与强毒力菌株SH040917杂交，获得61种毒力特异性基因片段。结果表明，这些片段与30个不同的蛋白质编码基因有关。它具有同源性，包括枯草样丝氨酸蛋白酶，DNA核酸酶，溶血素相关蛋白酶，苏氨酸磷酸化蛋白酶等。

戴建军通过SSH技术已对禽病原性大肠杆菌菌株和人尿来源的大肠杆菌的差异表达基因序列进行了相关研究，发现了28个新的毒力基因片段，并调查了这些基因片段的流行病学。新的毒力基因与流行病学具有更大的相关性。

2.4 SSH技术在生态学中的应用

Xiancheng等。

使用SSH技术构建了黄ba IV卵巢和相间性腺的c DNA消减文库，阳性。消减杂交使用相间性腺作为测试对象，IV期卵巢作为驱动对象。反向消减杂交以IV期卵巢为测试对象，相间性腺为驱动对象。将获得的扣除的c DNA连接到质粒载体中，然后转化大肠杆菌DH5α，得到的正向和反向扣除文库分别包含461,678个重组体。 PCR扩增和鉴定后，插入片段的范围为200至2,000 bp。从阳性和阴性文库中随机选择100个阳性克隆进行测序和分析，获得90个有效基因片段。从文库中选择两个基因进行半定量RT-PCR，并验证文库的质量。结果表明，构建的文库可以达到富集IV期性腺差异表达基因的目的。黄ical性腺性腺消减文库的构建为进一步分离鉴定黄ical中性腺发育和性逆转相关基因奠定了基础。

李超等

使用SSH技术以链球菌疫苗为免疫材料构建罗非鱼白细胞c DNA的免疫前后，并构建了罗非鱼免疫前后的正2c DNA消减文库，以及地高辛（DIG）标记的减去文库c DNA被用作探针来筛选和鉴定差异表达的片段。结果表明，两个文库的重组率均在90％以上，插入片段在300至900 bp之间。大于50％，减差效率很高，阳性率大于70％。杂交筛选后，从阳性和阴性文库中选择30个阳性克隆进行测序和聚类。正库和负库分别获得16,18个EST。通过Gen Bank分析获得的序列的同源性。在阳性和阴性文库中有10,11个EST获得功能注释，而6,7个unigenes没有同源性匹配，被鉴定为未知新基因。

刘静等。

使用SSH技术研究营养物对鲍鱼皱纹基因表达的影响，并在构建的文库中测序了48个克隆。结果，发现了32个已知的功能基因和16个。新基因。王佳等。

利用SSH技术研究了皱纹曲霉Vc缺乏诱导的差异表达基因，获得了63个基因片段，其中已知的功能基因为34;从c DNA库中获得了39个片段，其中21个是已知的功能基因，包括相关基因，例如细胞代谢和生物学调控。

此外，梅冰

使用SSH技术筛选和鉴定溶藻弧菌的毒力相关基因，以构建溶藻弧菌毒力菌株的SSH文库。结果表明，弧菌藻毒力菌株的SSH文库包含8个已知的常见毒力相关功能基因。该文库还包含166个未知新基因，占文库中基因总数的68.44％。溶藻弧菌毒力基因最有可能在这些未知的新基因中。结果表明，构建的SSH文库中的166个未知新基因可能含有溶藻弧菌的关键毒力基因，这为溶藻弧菌的毒力基因鉴定和开发溶藻弧菌基因工程疫苗奠定了基础。未来。重要基础。

3展望

在现代生命科学研究领域，差异基因的筛选和鉴定已成为现代分子生物学研究的热点。 SSH技术操作简单，所需的测试设备便宜，测试过程简单，阳性率高。它提供了一个强大的工具来隔离差异基因。随着SSH技术的不断改进，已在微生物学，动物学，植物学和医学等生物学研究的各个领域大力推广它。在未来的发展中，SSH将与其他各自具有优势的分子生物学技术相结合，为研究差异基因的表达提供新的技术手段。

参考文献：

抑制性差减杂交技术在基因克隆中的运用现状论文 2 顾可育，翟虎渠。抑制消减杂交技术及其在基因克隆中的研究进展[J]。生物技术通报，1999，15（2）：13-16。