家蝇幼虫抗菌物质最佳提取技术探索论文

2019-12-14 14:06:09 141

家蝇幼虫抗菌物质最佳提取技术探索论文

家蝇是中国常见的资源昆虫。研究发现，家蝇幼虫含有多种抗菌物质，包括天蚕素和昆虫防御素等蛋白质（Ma Hongxia等，2007）和非蛋白质，例如1-LPE（Meylaers等，2004），几丁质（ Sukontascn等，2000），尿囊素等（Moreira等，2003）。这些抗菌物质分子量小，热稳定性好，抗菌谱广（翟朝阳，1996），甚至抑制肿瘤细胞等特征（Mohammadet等，1995）。

使用基因工程克隆抗菌肽，这种肽很少，结果较差，并且蝇the中含有非蛋白质抗菌物质。这些物质不能通过基因工程。该方法是合成的，因此如何有效地制备抗菌物质是工业界一直在探索的问题。目前，国内对家蝇抗菌物质的研究主要集中在抗菌肽的诱导和单个蛋白的纯化上。例如，周永福等。（1997）探索了家蝇中抗菌肽的诱导条件。陆杰等。（2006年）分离出家蝇抗菌肽MD7095，鲁杰1的制备抗菌肽的方法，有关大规模工业制备抗菌物质的文献很少。

在陆杰等人采用的藻酸吸附，加热，冻干和重层析的制备方法中。（2007年），由于海藻酸的高成本和色谱样品的少量，大规模制备仍然有一些限制。切向流是大容量超滤系统。根据党向力（2008）的结果，可以使用10 kDa的小体积超滤浓缩管回收家蝇抗菌肽。基于这一结论，本文在加热后，采用切向流超滤和直接冷冻干燥的方法提取抗菌物质。通过分析比较，探讨了提取抗菌物质的最佳方法。

1材料和方法

1.1材料

实验蝇fly：Muscadomestica幼虫的测试菌株Muscadomestica幼虫在65°C干燥24 h：金黄色葡萄球菌ATCC6538，枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501，大肠杆菌0157NOTC12900，大肠杆菌罗塞塔，肠炎沙门氏菌CMCC（B）50335，痢疾志贺氏菌7CC10231（以上菌株购自广东省微生物研究所）主要试剂：GE Hiload Superdex 75（GEAmersham），LB培养基（Angie）主要仪器：色谱系统AKTA Explorer（GE Amersham），蛋白质电泳系统（GE Amersham），Constant温度培养箱（上海宜恒），粉碎机（Purun），真空冷冻干燥机（Jouan），蠕动泵（Lopump），10 kDa切向流膜包装（Sartorius）1.2方法。

1. 2.1蝇fly抗菌物质提取物的制备

用粉磨机将400克干蝇磨碎，将其溶于2升0.5 mol / L乙酸中。在4°C下静置10小时，在4°C下以8000 rpm离心15分钟，使上清液通过1000目筛网，并在100°C水浴中的水浴中放置10分钟，然后在4°C下离心在8000 rpm的温度下保持15分钟。将其清除并使用真空过滤装置通过0.22μm的滤膜，并将滤液用于浓缩抗菌物质。

1. 2. 2抗菌物质的浓缩

本文使用两种不同的方法来浓缩抗菌物质。具体方法：（1）超滤法：切向流超滤法（如图1所示），通过10 kDa切向流系统在4°C下浓缩1 L抗菌物质酸提取液至50 mL，得到浓缩溶液。（2）直接冷冻干燥法：将抗菌物质提取物分成几盘，然后真空冷冻干燥。将干燥的粉末重新溶解于50 mL的0.5 mol / L乙酸溶液中，然后离心以13000 rpm的速度除去沉淀物。获得可溶性浓缩溶液，用于测定蛋白质含量。

1.3.2凝胶过滤色谱法

请参考Zhong Ya（2007）的色谱条件，并对其进行适当的改进。用0.2 mol / L乙酸溶液平衡Superdex 75色谱柱。将上述浓缩物以13,000rpm离心后，使其通过0.22μm的针滤膜，将其中的2mL用于凝胶过滤色谱法。用0.2 mol / L乙酸以2.5 mL / min的速率进行洗脱，并根据在280 nm处的监测值收集与样品分离的组分。每管收集10 mL，冻干后，将各组分溶于1 mL蒸馏水中以检测抗菌活性。同时服用10 mL 0.2将mol / L乙酸冻干并溶解在1 mL蒸馏水中作为空白对照。通过切向流动法制备的色谱组分为A组，通过直接冷冻干燥法制备的组分为B组，空白组为C组。

1. 2. 4抗菌活性的检测

使用板打孔法，取OD600≈0.88 500μL测试细菌，并将其添加到20 mL预热的LB固体培养基中，混合后倒入板中。琼脂凝固后，打孔。将上述每种组分的40μL加入孔中。自然扩散30分钟后，将板置于37°C的培养箱中，孵育过夜。

1.2.5蛋白质含量的测定

用考马斯亮蓝法（Coligan，2003）测定可溶性蛋白质含量。

1. 2. 6蛋白质电泳

电泳使用Tricine-SDS-PAGE方法，参见Herman等人的方法。（1987），分离凝胶浓度为17％，浓缩凝胶浓度为5％，将20μL装入每个孔中。

2结果与分析

2.1。通过超滤获得了两种浓缩方法制备溶液中蛋白质含量的测定结果。抗菌物质为深棕色浓缩溶液，无沉淀。用冷冻干燥法制得的抗菌物质也为黑褐色，但有更多的沉淀。用考马斯亮蓝法制备的超滤法可溶性蛋白含量为10.2 mg / mL，而直接冻干法获得的可溶性蛋白含量仅为1.2 mg / mL。

2.2凝胶过滤层析结果

对通过超滤获得的浓缩溶液进行凝胶过滤层析后，收集25种组分（A1-A25）并通过冷冻干燥直接获得。浓缩溶液获得15种组分（B1-B15）。

2.3每种成分的抗菌活性分布

使用7种不同的测试细菌的切向流超滤浓度测试了液体和直接冻干浓缩液不同成分的抗菌能力。结果示于表1和表2。A1，A2，A10，A11，A12，A13，A20，A21具有抗菌活性，但抗菌谱不同。在这9种具有抗菌活性的成分中，A1，A2，A10，A11，A12，A13的抗菌谱较窄，仅对革兰氏阳性细菌和某些革兰氏阴性细菌具有抗菌能力，而A20 A21的抗菌谱较广，并且对几种测试细菌具有不同程度的抗菌作用。然而，通过考马斯亮蓝法，组分A1，A2，A10，A11，A12，A13的蛋白质含量均超过0.5 mg / mL，而A20，A21难以检测，它包含蛋白质，可能是非蛋白质成分。

将通过直接冷冻干燥法提取的蛋白质进行凝胶色谱法以获得15种成分。除B4和B14外，所有组分均具有抗菌活性。其中，B1和B2仅对革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性菌具有抑菌能力，且两种成分的蛋白质含量均超过0.2 mg / mL。 B6-B12具有广泛的广谱抗菌能力，对7种被测细菌具有不同程度的抑菌作用，并且具有很强的抗菌活性。它的抑菌圈超过1厘米，但该蛋白质无法被考马斯亮蓝检测到，并且可能是非蛋白质成分。

空白对照组C对6种测试细菌没有抑菌作用。

2.4活性成分的电泳结果

使用Tricine-SDS-PAGE进行电泳，每孔加样20μL。结果显示在图3中（由箭头指示）。在通过过滤分离的组分中，A 2以75kDa，48kDa，24kDa，17kDa和11kDa分布。 A11主要集中在9 kDa-41 kDa，而A12主要集中在25 kDa-34 kDa。 7 kDa-18 kDa，A13主要集中在25 kDa-33 kDa，15 kDa-17 kDa和6 kDa -12 kDa的三个片段中。电泳后A20和A21没有显示明显的条带（图中未显示）。基于蛋白质浓度的确定，确定其为非蛋白质物质。 B1和B2主要集中在15 kDa-17 kDa和6 kDa-10 kDa的两个片段中。电泳后，B5-B11未显示任何条带（未图示），结合蛋白浓度的测定结果也被推定为非蛋白质物质。

A11和A12具有比A13，B1和B2更好的抗菌强度。比较A11，A12，A13，B1和B2的电泳带，可以看到一部分蛋白质抗菌物质在此范围内为11 kDa-41 kDa。 A2具有一定的抗菌活性，但是由于该抗菌物质在制备过程中要经过沸水浴，因此电泳图中100 kDa，75 kDa和48 kDa谱带的位置是少量具有没有被热变性并且没有抗菌活性。 24 kDa，17 kDa和11 kDa带是具有抗菌活性的蛋白质。

3结论和讨论

家蝇含有多种抗菌肽，它们对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有效。有一定的杀灭作用。抗菌肽的大规模制备仍处于探索阶段。陆杰（2007）等。加热后采用藻酸吸附，直接冻干，重层析的方法进行提取。使用藻酸吸附方法不能获得更高的产率，并且藻酸更昂贵。尽管加热色谱法提高了产率，但是色谱法不适合大规模工业生产。因此，上述两种方法不是工业上最佳的方法。据党向力（2008）研究表明，使用10 kDa超滤浓缩管进行超滤，抗菌肽的回收率可达到99％。由于浓缩管中超滤的流向垂直于滤膜，因此切向流超滤的方向与滤膜平行，因此切向流超滤不仅可以提高回收率，而且可以与试管超滤的浓度相比，一次的样品量更大。在这项研究中，通过10 kDa切向流系统加热后，采用了超滤和直接冻干两种方法来提取抗菌肽。结果表明，通过切向流超滤获得的可溶性蛋白质的量通过直接冻干是可溶的。蛋白质量的8.5倍。考虑到切向流超滤是一种简单的设备，因此只需要定期清洁即可使用。这是减少大规模工业生产成本的简单有效的方法。

在比较两种制备方法制备的抗菌物质的成分分析时，本研究采用凝胶过滤色谱法，采用Superdex 75凝胶过滤色谱柱，参考钟亚层（2007）的分析方法。条件和流量适当改变。通过分离通过两种提取方法获得的抗菌肽，获得了两个不同的洗脱峰。通过超滤提取的蛋白质进行色谱分离后，在A280处获得多个吸收峰，并且所收集的蛋白质组分的抗菌谱不如非蛋白质组分的宽。通过直接冷冻干燥法提取的蛋白质在A280处只有两个峰，但抑菌试验和蛋白质含量试验结果表明，未能检测到该蛋白质的成分在抗菌谱或抗菌活性方面都更好。经过TricineSDS-PAGE后，通过分析和比较，可以对蛋白质的抗菌物质的组成分布进行不同的测量，但是可以粗略得出结论，抗菌物质的分布范围为11 kDa -41 kDa，但是蛋白质的组成无法测量。没有获得电泳图，这进一步证实了这些组分是非蛋白质的。

在凝胶过滤色谱法中，有许多物质的蛋白质含量无法通过考马斯亮蓝法测量，但在A280中具有很高的吸光度值，并且可以确定蛋白质的检测结果。成为非蛋白质抗菌成分。除抗菌肽外，家蝇还含有非蛋白质抗菌物质，例如Meylaers等。（2004）。用甲醇从家蝇中提取抗菌物质1-LPE，分子量为451.2 Da。此外，还发现了几丁质。非蛋白质抗菌物质，例如血浆和尿囊素（Craezyk等，2001）它们分子量小，具有抗菌，真菌和病毒作用。尿囊素还可以促进伤口愈合（罗金祥等，2005）。尿囊素在A293处具有很强的吸光度，是壳聚糖的衍生物。该物质在A260处具有最大吸光度，这些非蛋白质抗菌成分在A280处也具有一定的吸光度。

凝胶过滤色谱分析表明，在制备抗菌物质的方法中，切向流超滤法比直接冷冻干燥法获得的非蛋白质抗菌成分具有更多的蛋白质抗菌成分。减。

蛋白质电泳的结果还显示10 kDa切向流超滤可以有效地回收复合抗菌物质中的抗菌蛋白质成分。

基于以上结果，可以看出，虽然切向流超滤有效地凝结了蛋白质抗菌成分，但非蛋白质抗菌成分也通过了切向流超滤系统。非蛋白质抗菌物质可以通过喷雾干燥和其他方法进行浓缩和干燥。在此过程中，可以分离基于蛋白质的抗菌成分和基于非蛋白质的抗菌成分，同时确保最大程度地回收基于蛋白质的抗菌物质。